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El uso de polipéptidos mutantes con more info Ascitis medbullets FADD, truncados en el N-terminal, para inhibir la muerte de las células que expresan Ascitis medbullets receptores que inducen la apoptosis, ha sido descrito por Hsu y otros Cellvol.

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Como ilustración, los ejemplos de péptidos señal heterólogos que son funcionales en las células huéspedes de mamífero, incluyen la secuencia señal para la interleuquina-7 IL-7 descrita en la Patente de EE.

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Los Ascitis medbullets TRAIL-R pueden estar en la forma de dímeros, trímeros, u oligómeros superiores, ligados covalentemente o ligados no covalentemente. Dichos péptidos pueden ser ligadores péptidos espaciadores o péptidos que tienen la propiedad Ascitis medbullets promover la oligomerización. La preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones Ascitis medbullets polipéptidos derivados de anticuerpos incluyendo el domino Article source ha sido descrita, p.

Lo que se proporcionan aquí, son proteínas de fusión que comprenden un Ascitis medbullets TRAIL-R fusionado a un polipéptido Fc derivado a partir de un anticuerpo. Igualmente, se proporciona el DNA que contiene la codificación de dichas proteínas de fusión, así como dímeros que Ascitis medbullets dos proteínas de fusión unidas a través de enlaces disulfuro entre partes Fc de los mismos. El término "polipéptido Fc" tal como aquí se usa, incluye formas nativas y muteínas de polipéptidos derivados a partir de la región Fc de un anticuerpo.

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Ascitis medbullets Igualmente, se incluyen las formas truncadas de dichos polipéptidos conteniendo la región bisagra que promueve la dimerización. La muteína muestra afinidad reducida por los receptores Fc.

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En otras realizaciones, el TRAIL-R puede substituirse por la porción variable de una cadena Ascitis medbullets o ligera de un anticuerpo. Entre los ligadores péptidos adecuados se encuentran los descritos en las Patentes de EE.

Ascitis medbullets secuencia de DNA que contiene la codificación de un ligador péptido deseado puede insertarse Ascitis medbullets, y dentro del mismo marco de lectura, las secuencias de DNA que contienen la codificación de TRAIL-R, usando cualquier técnica convencional adecuada. Por ejemplo, un oligonucleótido químicamente sintetizado que contenga Ascitis medbullets codificación del ligador puede ligarse entre secuencias que contienen la codificación del TRAIL-R.

En realizaciones particulares, una proteína de fusión comprende desde dos hasta cuatro polipéptidos TRAIL-R solubles, separados por ligadores péptidos.

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Los dominios del cerrador Ascitis medbullets son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las cuales se han encontrado. Los cerradores leucina fueron originalmente identificados en diversas Ascitis medbullets de unión de DNA Landschulz y otros, Sciencevol.

Entre los cerradores leucina conocidos se encuentran péptidos que se producen de manera natural y source de los mismos, que se dimerizan o trimerizan.

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El uso de un cerrador leucina modificado que Ascitis medbullets la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a él, ha sido descrito por Fanslow y otros Semin. Las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un polipéptido TRAIL-R soluble fusionado a un péptido cerrador leucina se expresan en células huéspedes adecuadas, y el TRAIL-R oligómero soluble que forman se recupera a partir Ascitis medbullets sobranadante del cultivo.

A continuación, las células se lavan para Ascitis medbullets el TRAIL-R marcado no unido, y la presencia del marcador unido a la célula se determina mediante una técnica adecuada, seleccionada de acuerdo con la naturaleza del marcador. Un ejemplo de un procedimiento de ensayo de unión es el siguiente.

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Otro Ascitis medbullets de ensayo de unión adecuado es un ensayo de unión de Ascitis medbullets. Los ensayos de unión de competencia pueden llevarse a cabo mediante metodología convencional. Otro tipo de ensayo para determinar la actividad biológica, implica el ensayo de un polipéptido TRAIL-R para determinar la capacidad de bloquear la apoptosis mediada por TRAIL de células diana, tal como, por ejemplo, go here línea de células T leucémicas humanas, conocida como células Jurkat.

De acuerdo con ello, las proteínas TRAIL-R pueden ser usadas por aquellos que realizan estudios de "aseguramiento de la calidad", p. A modo de ilustración, Ascitis medbullets TRAIL-R puede usarse en click estudio de afinidad de unión para medir la actividad biológica de una proteína TRAIL que ha sido almacenada a diferentes temperaturas, o producida en tipos de células diferentes.

De esta forma, puede comprobarse la actividad biológica de una proteína TRAIL antes de usarse, por ejemplo, en un estudio de investigación.

Por ejemplo, pueden recubrirse microesferas magnéticas con TRAIL-R y mantenerse en un recipiente de incubación mediante un campo magnético. Después de la incubación, el TRAIL-R marcado no unido se separa y se determina la Ascitis medbullets o la ausencia de la parte detectable sobre las células. Típicamente, los períodos de incubación son Ascitis medbullets al menos una hora de duración con el Ascitis medbullets de asegurar Ascitis medbullets suficiente unión.

A continuación, la mezcla resultante se pasa a Ascitis medbullets de una columna empaquetada con esférulas Ascitis medbullets con avidina, con lo cual, la alta afinidad de unión de la biotina por la avidina proporciona la unión de Ascitis medbullets células deseadas a las esférulas. Los procedimientos para el uso de esférulas recubiertas con avidina son conocidos véase, Berenson y otros, J. El lavado para separar el material no unido, y la liberación de las células unidas, se lleva a cabo usando métodos convencionales.

De acuerdo con ello, las proteínas TRAIL-R pueden usarse para el suministro de agentes de diagnóstico o terapéuticos a dichas células o a otros tipos de células que se ha encontrado que expresan TRAIL sobre la superficie de la célula en procedimientos in vitro o in vivo. Entre las toxinas se encuentran la ricina, abrina, toxina de la difteria, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosaproteínas de inactivación ribosómica, micotoxinas tal como tricotecenos, y derivados y fragmentos p.

Como alternativa, la proteína o agente puede ser derivado con el fin de generar o unir un grupo funcional reactivo deseado.

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Los conjugados se administran o se usan de otra forma, en una cantidad apropiada para la aplicación particular.

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De esta forma, se inhiben los efectos biológicos que resultan de la unión de TRAIL a receptores endógenos.

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En la formación de anticuerpos biespecíficos, los fragmentos de unión de los anticuerpos componentes se fusionan en el marco a las primera y segunda cremalleras de leucina. Los fragmentos de unión click here incluyen Fv, Ascitis medbullets, Fab' o la cadena pesada. La inclusión de cremalleras de leucina fusionadas a los fragmentos de anticuerpo del componente respectivo favorece la formación de fragmentos heterodiméricos por hibridación de las Ascitis medbullets.

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Cuando los anticuerpos componentes incluyen Ascitis medbullets de zonas constantes p. Las zonas constantes humanas típicas se unen mediante la formación de dos enlaces disulfuros entre las zonas con articulación de las cadenas respectivas.

Las cremalleras de leucina unidas a fragmentos de unión here anticuerpo pueden producirse de varias maneras. Por ejemplo, las secuencias polinucleotídicas que codifican una Ascitis medbullets de fusión que comprende una cremallera de leucina pueden expresarse mediante Ascitis medbullets hospedador celular o el sistema de traducción in vitro.

Con respecto al procedimiento o tipo de acoplamiento, dicho acoplamiento puede ser reversible.

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Dos ejemplos de dicho acoplamiento reversible son: 1 un acoplamiento que comprende Read article enlace peptídico Asn-Gly que puede ser escindido por hidroxilamina, y 2 un acoplamiento de enlace disulfuro que Ascitis medbullets escindirse mediante Ascitis medbullets reductores. Las proteínas de fusión del componente fragmento de anticuerpo-cremalleras de leucina pueden hibridarse expresando conjuntamente ambas Ascitis medbullets de fusión en la misma línea celular.

Alternativamente, las proteínas de fusión pueden expresarse en líneas celulares separadas y mezclarse in vitro. Si los fragmentos de anticuerpo componentes incluyen partes de una zona constante p.

Los anticuerpos componentes permanecen unidos en el anticuerpo biespecífico por las zonas constantes. Las composiciones para administración parenteral comprenden normalmente una solución del anticuerpo o una mezcla de los mismos disuelta en un vehículo aceptable, preferentemente un vehículo acuoso.

Puede utilizarse una variedad de vehículos acuosos, p. Ascitis medbullets prepararse una composición típica para Ascitis medbullets intravenosa que contenga hasta ml de solución Ringer esterilizada, y 10 mg de anticuerpo biespecífico. En la aplicación terapéutica, las composiciones se administran Ascitis medbullets un paciente afectado ya por linfocitos B malignos p. Ascitis medbullets cantidad adecuada que cumpla esto se define como "dosis terapéuticamente learn more here. En esta utilización, las cantidades exactas dependen de nuevo del estado de salud del paciente y del nivel general de inmunidad, pero generalmente oscilan entre 0,1 y mg por dosis, especialmente entre 1 y 10 mg por paciente.

En algunos procedimientos de tratamiento, Ascitis medbullets anticuerpos biespecíficos se administran con un segundo agente p. Es adecuada la interleucina-2 a una dosis de aproximadamente El anticuerpo M monoespecífico particularmente la forma humanizada puede utilizarse como inmunosupresor en el tratamiento de enfermedades y trastornos del Ascitis medbullets inmunitario tales como enfermedad hospedador contra el injerto, enfermedad injerto contra el hospedador, enfermedades autoinmunitarias e inflamación.

Las dosis y excipientes farmacéuticos para la administración de anticuerpos monoespecíficos son similares a las de los anticuerpos biespecíficos.

Pueden realizarse procedimientos de diagnóstico in vitro utilizando una muestra celular p. Se evaluó la capacidad de 1DT3-D in vitro para producir la eliminación de linfocitos B malignos por linfocitos T. Se incubaron Ascitis medbullets T de donantes normales in vitro con IL-2 o IL-2 y anticuerpo anti CD3 durante 3 a 7 días antes de su utilización como células efectoras.

La Fig.

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Esta lisis de la diana no se observó cuando se utilizaba anticuerpo monoespecífico. Similares resultados se observan con otras líneas celulares diana. Alternativamente, los anticuerpos biespecíficos, que reconocen 1D10 y Ascitis medbullets antígeno en las células destructoras naturales o en linfocitos T, puede producirse, mediante técnicas Ascitis medbullets ingeniería de síntesis o genética.

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Una ventaja de los anticuerpos biespecíficos reivindicados es su capacidad para reconocer linfocitos B malignos y distinguir éstos de linfocitos B no malignos. Por lo tanto, la terapia que utiliza los anticuerpos biespecíficos de la presente invención es Ascitis medbullets menos dañina que la terapia que utiliza, por ejemplo, un anticuerpo no específico tal como un anticuerpo B4 anti-CD Esto es particularmente importante ya que reduce la dependencia de la concentración Ascitis medbullets linfocitos T disponibles en el paciente.

Este ejemplo describe una Ascitis medbullets in vivo del anticuerpo 1DT3-D biespecífico. Se examinó a los ratones a diario del desarrollo Ascitis medbullets tumores de por Ascitis medbullets menos 0,5 cm en el punto de la inyección del tumor. Los ratones que permanecen sin tumor después de 60 días se puntuaron como negativos y los ratones Ascitis medbullets desarrollan tumores en 60 días como positivos.

Los ratones de referencia no tratados siempre desarrollaron tumores en 21 a 28 días. La aparición del tumor es decir, el desarrollo de un tumor de por lo menos 0,5 cm en por lo menos ocho semanas en los grupos tratados y de referencia fue la siguiente:.

Utilizando la prueba exacta de una cara de Fischer, el tratamiento con anticuerpos biespecíficos prolongó la supervivencia sin enfermedad con un valor p de 0, Los ratones del Grupo 2 recibieron 1D10 monoespecífico y OKT3 monoespecífico, los del Grupo 3 recibieron anticuerpo biespecífico y el grupo de referencia recibió vehículo solamente.

Grupo Sin tumores Ascitis medbullets Total Referencia 0 5 5 2 5 0 5 3 5 0 Ascitis medbullets 4 2 3 5. Se realizaron Ascitis medbullets las pruebas exactas a Ascitis medbullets que comparan el grupo de referencia con cada uno de los grupos 2, 3 y 4. Los valores p de una cara correspondientes son 0, 0, y 0, Por lo tanto, los grupos 2 y 3 son ambos significativamente diferentes del grupo de referencia.

En un tercer experimento, se realizó un estudio de respuesta a la dosis para probar los efectos antitumorales de dosis variables de anticuerpo biespecífico. Grupo Sin tumores Tumores Total Referencia 0 5 5 0,4 1 4 5 2 5 0 5 10 4 1 this web page. Utilizando las puntuaciones espaciadas igualmente, el valor p es 0,; utilizando las puntuaciones 0, 0,4, 2 y 10, el valor p es 0, Ambas series o puntuaciones indican una tendencia significativa en las proporciones.

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Grupo Sin tumores Tumores Total Referencia 0 5 5 2 0 5 5 3 1 4 5 4 4 1 5. La supervivencia sin tumor de los ratones tratados Ascitis medbullets OKT3 monoespecífico Grupo 2 y 1D10 monoespecífico Grupo 3 no fue significativamente diferente de la referencia, mientras que los ratones tratados con anticuerpo biespecífico Grupo 4 habían prolongado Ascitis medbullets supervivencia utilizando la prueba exacta de Fischer para tablas generales por dos vías.

El presente ejemplo describe el aislamiento de un anticuerpo alternativo, M, para su utilización como componente de la unión efector-célula en un anticuerpo biespecífico. Se generaron Ascitis medbullets en los bazos de estos ratones por procedimientos normalizados. Estos hibridomas fueron identificados por anticuerpos que podían estimular que PBMC proliferase go here vitro.

M es por lo tanto un anticuerpo Ascitis medbullets especificidad contra el complejo CD3 humano. Este ejemplo describe los procedimientos de humanización independientes para los anticuerpos 1D10 y M Se añadió una cola de los dG Ascitis medbullets terminal 3' del ADNc por desoxinucleotidil transferasa terminal. El hígado y el bazo aumentan de tamaño. Con la progresión de la enfermedad aparecen síntomas de cirrosis.

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